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编号	623
名称	CRISPR Off-target Scoring (Elevation)
封面
描述	Elevation 用于预测 CRISPR-Cas9 在候选脱靶位点的切割活性，并评估单条向导 RNA 的总体脱靶风险。
标签	Biologics DNA/RNA
作者	Jennifer Listgarten
发布时间	2026-10-16 10:41:00
参考文献	Jennifer Listgarten, Michael Weinstein, Benjamin P. Kleinstiver, Alexander A. Sousa, J. Keith Joung, Jake Crawford, Kevin Gao, Luong Hoang, Melih Elibol, John G. Doench, Nicolo Fusi, 2018, Prediction of off-target activities for the end-to-end design of CRISPR guide RNAs, Nature Biomedical Engineering, 2:1 Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, Smith I, Tothova Z, Wilen C, Orchard R, Virgin HW, Listgarten J, Root DE, 2016, Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9, Nature Biotechnology, 34:2

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简介
参数说明
Guide Off-target Pairs
Output
结果说明
参考文献

CRISPR Off-target Scoring (Elevation)

简介

Elevation 由 Microsoft Research 的 Jennifer Listgarten、Nicolo Fusi 与 Broad Institute 的 John G. Doench 等人在 2018 年提出，论文发表于 Nature Biomedical Engineering。CRISPR-Cas9 用一段向导 RNA（guide RNA）定位目标 DNA，但相似序列上也可能被切开，这就是脱靶（off-target）。Elevation 要回答两件事：某个脱靶位点有多可能被切开，以及一条 guide 把这些位点合在一起看时脱靶负担有多大。

位点分数是两层模型。第一层用梯度提升树，学习单个错配或非 NGG 前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）的活性；第二层用带 L1 惩罚的线性回归，把一条位点上的多个单错配预测合并成一个分数。论文再对这个分数做 logistic 校准。汇总分则用另一组梯度提升树，输入是这条 guide 各位点分数的分布，并区分基因区和非基因区。

两层模型示意：多个错配先拆成单错配并各自打分，再合并成一个位点分数；一条 guide 的各位点分数再汇总成一个分数。图中的 0.77、0.21、0.43 和 0.78 是论文示意图中的例子，不是本模块的输出。图来自 Listgarten 等，Nature Biomedical Engineering，2018，Figure 1。

位点模型在 CD33（4,853 对）、GUIDE-seq（294,534 对）上训练，在去掉 GUIDE-seq 之后的 Haeussler 等数据（10,129 对）上测试，再对调 GUIDE-seq 与 Haeussler 的角色做一次。比较对象是 CFD、Hsu-Zhang 和 CCTOP。纵轴是相对 CCTOP 的加权 Spearman 改进，横轴从更重视高活性位点逐渐变为普通 Spearman。Elevation 在整段权重上都高于另外三种方法。普通 Spearman（曲线最右端）在前一种划分中分别为 Elevation 0.117、CFD 0.100、Hsu-Zhang 0.101、CCTOP 0.007；对调之后分别为 0.059、0.057、0.053、0.043。GUIDE-seq 与 Haeussler 数据里分别只有 0.12% 和 0.51% 的计数不为 0，所以这个相关系数看起来不高。论文最终采用在 GUIDE-seq 上训练的位点模型。

位点分数相对 CCTOP 的加权 Spearman 改进。左图用 CD33 与 GUIDE-seq 训练、Haeussler 等数据测试；右图对调 GUIDE-seq 与 Haeussler 的角色。图来自 Listgarten 等，Nature Biomedical Engineering，2018，Figure 2。

汇总模型用非必需基因的活力筛选来训练：脱靶越多，细胞越可能死亡。Avana 有 4,950 条 guide，Gecko 有 4,697 条。无论用哪一套训练、另一套测试，Elevation 的加权 Spearman 都高于 CFD 网站和 MIT 网站，MIT 网站的相关经常与表型方向相反。论文云服务使用在 Avana 上训练的汇总模型。

活力筛选上的 guide 汇总分。左图用 Avana 训练、Gecko 测试，右图相反。MIT 网站的相关经常为负。图来自 Listgarten 等，Nature Biomedical Engineering，2018，Figure 5。

上面两张性能图评价的是论文中的原模型和基因组范围的搜索，不是本模块这次计算的实测。本模块只对用户提交的配对打分，不搜索基因组，也不预测在靶活性。基因区标记来自 FASTA 标题，不是 Ensembl。因此 Figure 5 的相关系数不能当作本模块 Aggregate_Score 的性能。位点分数是用 scikit-learn 0.22 重拟合 linear-raw stacker 后再做 logistic 校准的，可能与原仓库 scikit-learn 0.18.1 的数值略有差别。实现中的 CFD 与上游成对预测对照一致，guide 汇总与上游汇总对照一致。

适用的是 Streptococcus pyogenes Cas9、以错配而不是插入或缺失为主的脱靶问题。模型训练数据来自人类细胞的 CD33、GUIDE-seq、Haeussler 等数据和 Avana、Gecko 筛选。其他核酸酶、其他物种，或没有被放进输入文件的位点，都不在这些证据里。用户少交或多交位点，汇总分都会变。

参数说明

Guide Off-target Pairs

上传一个 FASTA 文件，格式标记为 FASTA。每条记录只含一行序列，写成 guide:offtarget。两条序列通常都是 23 nt，前 20 nt 是紧邻 PAM 的间隔序列，最后 3 nt 是 PAM。标题按逗号分成记号，其中有一个 genic（不区分大小写）时，该脱靶位点记为基因区；没有这个记号则为非基因区。记录名不参与分组，汇总按 guide 序列本身合并。

只有脱靶位点已经是 23 nt、guide 只有 20 nt 时，guide 末尾会补上 NGG。补上的 N 不记为错配。U 会按 T 读取。长度无法变成 23 nt、含有 A/C/G/T/N 以外的字符，或一条记录里没有恰好一个冒号时，该行会被跳过。

>g1,genic
GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG:GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG
>g1
GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGG:GAGTTAGAGCAGAAGAAGAAAGG

第一条的标题有 genic，序列左右两边都是 23 nt，右边是完全一致的脱靶位点。第二条没有 genic，记为非基因区；冒号右边是另一个脱靶位点。同一条 guide 可以写很多条记录。

Output

结果文件名，默认 scores.csv。

结果说明

输出文件名称	说明
scores.csv	`predict` 写出的评分表。每一行是一对 guide 与脱靶位点；同一条 guide 的每一行带有相同的汇总值。

scores.csv 说明如下：

字段	说明
Guide	23 nt 的 guide，含末尾 PAM。仅在脱靶位点已是 23 nt 时，20 nt 的 guide 会补成 `NGG`。
Offtarget	23 nt 的脱靶位点，含末尾 PAM。
Annotation	错配和非 `GG` PAM 的标记。空字符串表示前 20 nt 一致，且脱靶位点最后两位是 `GG`。
Cfd	切割频率测定（cutting frequency determination, CFD）分数。从 1 开始，按 Doench 等 2016 年 CFD 表里的 Percent-Active 连乘；没有可乘项时等于 1。越高表示 CFD 估计的切割活性越高。保留四位小数。
Elevation	校准后的位点分数，取值在 0 到 1 之间。论文把它作为该位点发生脱靶活性的概率；越高越可能有活性。保留四位小数。
Is_Genic	该行标题是否带有 `genic`。取值是 `true` 或 `false`，不是基因组注释查询的结果。
N_Sites	这次输入中，该 guide 成功评分的位点数。同一条 guide 的每一行相同。它不是基因组里的全部潜在位点。
Aggregate_Score	用该 guide 这些位点的 Elevation 分数和基因区标记汇总出的一个分数。越高表示预期脱靶负担越大，用来给 guide 排序。它不是 0 到 1 的概率，也没有固定上下限。同一条 guide 的每一行相同。保留四位小数。

Annotation 的写法：T:C,5 表示间隔序列第 5 位（从 PAM 近端的 20 nt 起、从 1 数）上，脱靶位点是 T、guide 是 C。单独的两位字母如 AG 表示脱靶位点最后两位是 AG 而不是 GG。多项用分号连接，非 GG 的 PAM 在前，错配按位置从 1 到 20 排列。N 不记为错配。

注意：

空的 Annotation 表示间隔序列和 PAM 末两位都匹配，不是缺失值。
N_Sites 和 Aggregate_Score 只统计本次成功评分的行。漏掉真实脱靶位点，或把无关序列放进来，都会改变汇总分。
某个 guide 的基因区位点或非基因区位点不超过 2 个时，对应的分组统计不会进入汇总模型，汇总主要反映全部位点的分布。
不同输入文件上的 Aggregate_Score 不能直接比较，也不能代替论文里基因组范围的 guide 分数。
无效行不会出现在表中。全部行都无效时，这次计算失败。

参考文献

Jennifer Listgarten, Michael Weinstein, Benjamin P. Kleinstiver, Alexander A. Sousa, J. Keith Joung, Jake Crawford, Kevin Gao, Luong Hoang, Melih Elibol, John G. Doench, Nicolo Fusi, 2018, Prediction of off-target activities for the end-to-end design of CRISPR guide RNAs, Nature Biomedical Engineering, 2:1, DOI: 10.1038/s41551-017-0178-6
Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, Smith I, Tothova Z, Wilen C, Orchard R, Virgin HW, Listgarten J, Root DE, 2016, Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9, Nature Biotechnology, 34:2, DOI: 10.1038/nbt.3437