gRNA Off-Target Analysis

该模块用于分析 gRNA 在参考基因组中的潜在脱靶情况。分析完成后，每条 gRNA 会得到不同错配数量下的匹配位点数，以及用于评估脱靶风险的特异性评分。

本模块适合已经获得 gRNA 序列及其基因组位置，进一步比较不同 gRNA 特异性。

参数说明

Input

上传待分析的 gRNA 表格。文件包含 id、sequence、pam、chromosome、position、sense 六列，说明如下：

输入示例：

注意：

• id、序列、PAM、染色体、位置和方向均不能为空。
• 同一表格中的 id 必须唯一。
• 每个单元格中不要使用逗号或换行。
• chromosome 可以带 chr 前缀，也可以不带，但必须与所选参考基因组中的染色体名称对应。
• position 是输入 gRNA 的位置，从 1 开始计数。

Reference

选择参考基因组。参考基因组必须与 gRNA 的来源物种和基因组版本一致，否则染色体位置和分析结果可能不准确。默认：hg38

当前支持以下参考基因组：

Mismatches

设置允许搜索的最大错配碱基数，可选择 0、1、2 或 3，默认值为 1。数值越大，搜索范围越广，可能找到更多潜在脱靶位点，但分析时间也可能增加。只需要查找完全匹配位点时选择 0。

Alternative PAM

设置除输入表格中 PAM 之外，还需要纳入搜索的替代 PAM。默认值为 NAG。如果不需要搜索替代 PAM，可以将该项留空。PAM 只能包含 A、C、G、T、N，其中 N 表示任意碱基。

RNA Bulges

设置允许的 RNA bulge 数，非负整数，默认 0。每个 bulge 长度为 1 个碱基，不计入错配数。这些命中记在结果的 rna_bulge_matches 列，不计入 distance_*_matches。保持 0 时只按错配搜索。

DNA Bulges

设置允许的 DNA bulge 数，非负整数，默认 0。每个 bulge 长度为 1 个碱基，不计入错配数。这些命中记在结果的 dna_bulge_matches 列，不计入 distance_*_matches。保持 0 时只按错配搜索。

Output

设置结果文件名，默认文件名为 processed.csv。同名 SAM 会一并写出。例如结果文件为 processed.csv 时，同时生成 processed.sam。

结果说明

默认输出 processed.csv 和 processed.sam。processed.csv 中每一行对应输入表格中的一条 gRNA，不会为每个脱靶位点分别生成一行。

processed.sam 只包含零错配且不含 bulge 的比对。一条 gRNA 有多处完全匹配时会有多行；没有完全匹配的 gRNA 不会出现在该文件中。

注意：

• 最大错配数设置为 0、1 或 2 时，未纳入搜索的更高错配列留空。
• 有多处零错配位点时，只有其中一处与输入的染色体、位置和方向一致，才会写下该位点；否则 chromosome、position、sense 为 NA。
• distance_0_matches 可能包含预期的目标位点，因此不应直接将该数值全部视为脱靶位点。
• specificity 主要用于在同一分析条件下比较不同 gRNA。完全没有命中时，该值为 1.0。
• 比较不同 gRNA 时，应确保它们使用相同的参考基因组、最大错配数、替代 PAM、RNA Bulges 和 DNA Bulges。

参考文献

• Schmidt H., Zhang M., Chakarov D., et al. 2025, Genome-wide CRISPR guide RNA design and specificity analysis with GuideScan2, Genome Biology, 26:1, DOI: 10.1186/s13059-025-03488-8