Binder Design (BoltzGen) HTS

简介

设计能够结合各种生物分子靶标的蛋白、肽类等生物分子。模块基于BoltzGen模型实现，BoltzGen是一个通用的全原子生成模型（all-atom generative model），能够在同一框架下完成多模态的binder设计任务。不同于前代模型只做“推断”，BoltzGen直接在扩散采样过程中生成目标分子与其结合体的全原子结构，并通过可控约束机制确保生成结果物理一致、功能可实现。同时具备良好的泛化性能，能够针对训练过程中未出现过的全新靶标进行有效设计。

BoltzGen的方法设计承接了Boltz系列一贯的目标——在统一的几何表示与能量空间中，学习多模态分子的物理规律。与以往的预测模型不同，BoltzGen 并不输出单一结构预测，而是通过扩散建模（diffusion modeling）直接生成分子的全原子坐标。

其采用扩散模型（diffusion model）框架，在全原子坐标空间中学习分子结构的分布。模型通过在每个采样步骤中向原子坐标加入高斯噪声，再逐步去噪恢复，从而近似真实的势能面分布。与传统的分子生成模型（如仅在残基层面建模）不同，BoltzGen的每个采样变量都是具体原子的位置向量。模型通过能量一致性约束（energy consistency）学习键长、键角、二面角等局部几何关系，从而在生成时自动保持化学合理性。这里对于全原子建模采用了Atom14的方法。

这一设计使生成结构不仅在形状上接近真实蛋白，在能量上也符合分子物理规律。

BoltzGen的架构如下图所示，由三大模块组成：输入层（Input Representation）、条件编码器（Condition Encoder）、扩散模型（Diffusion Model），输出为三维坐标的全原子结构。

BoltzGen的一个突出特点，是并非停留在计算层面的生成验证，而是进行了系统的湿实验评估。进行了十类实验任务（如下图所示），涵盖 蛋白质、肽类、环肽、小分子结合体及抗菌肽设计等多种体系，几乎囊括了现有结构设计模型所能覆盖的全部生物模态。这些实验的共同目标，是检验模型能否在“无同源模板、真实实验条件”下生成可表达、可结合的结构。不同于以往只验证折叠精度的预测模型，BoltzGen的验证标准是功能实现——即所生成分子是否能在实验中稳定结合目标。

BoltzGen 的实验结果显示出较高的一致性与通用性：

• 在 26 个实验靶标中，有超过 60% 的生成候选在实验中表现出结合活性；
• 模型生成的肽类与蛋白 binder 均表现出良好的可表达性（多数 >80% 可溶性）；
• 环肽和抗菌肽任务中，多个样本在无模板条件下仍能正确形成环化结构；
• 小分子结合蛋白任务中，生成结果的结合构象与已知复合物 RMSD < 2.5 Å。
  

在 BoltzGen 论文中，进行抗体和结合蛋白生成的湿实验验证时，抗原（目标蛋白）的主要输入方式是结构，但在特定情况下也可以通过序列输入。

具体说明如下：

默认输入方式：结构
论文中明确提到，除非另有说明，实验中均是将目标的结构（structure）作为输入提供给 BoltzGen 。例如，在针对 9 个新型目标（Novel Targets）设计纳米抗体和蛋白质结合剂时，研究人员利用了目标的结构信息。

灵活性：序列输入与协同折叠（Cofolding） BoltzGen 是一个全原子生成模型，能够同时进行结构预测和蛋白质设计 。当仅提供目标的序列（sequence）作为输入时，模型可以在设计结合剂的同时对目标进行折叠，最终生成结合复合物的原子结构 。

特殊案例：

• 无结构输入
  在针对 NPM1 蛋白的无序区（disordered region）设计多肽时，研究人员采用了“无结构输入”的策略 。他们提供了 NPM1 有序区域的结构，但让无序区域保持柔性，从而测试模型在处理缺乏固定结构的目标时的表现。
• 小分子目标
  对于小分子目标，BoltzGen仅需要输入SMILES字符串（一种描述分子结构的序列表示法），并在设计过程中执行协同折叠。

总结来说，虽然BoltzGen具备直接从序列出发进行设计的能力，但在该论文的大多数湿实验验证（特别是针对新型蛋白目标）中，结构是主要的输入方式。

计算耗时

参数说明

De Novo Antibody

Type

指定抗体类型，目前支持Antibody(普通抗体)和Nanobody(纳米抗体)。

Antigen Structure

上传已有的抗原结构，PDB或CIF格式。

Antigen Chains

指定从结构中提取一些链作为抗原，可多选，如：A,B。如不设置该参数，表示提取结构中的所有链。

Antigen Sequence

如果没有已知的抗原结构，可上传抗原序列，fasta格式，支持多链。

Binding Hotspot

指定抗原中的哪些残基参与结合，使用链名+残基位置（从1开始的顺序编号）进行指定，如A10-20,A25,B30-36,B40。
表示：抗原结合位点为A链编号10至20、25的残基，B链提编号30至36、40的残基。
注意：
1，在使用抗原序列文件时，链名是按字母顺序命名（与链的位置顺序对应），第一条链的链名为A，第二条链的链名为B，依次命名。
2，如不设置该参数，模型会自主寻找潜在的结合位点。

Custom Templates

支持上传自定义的抗体或纳米抗体模板结构，会采用模板结构的FR区，对CDR区域（Chothia编号）进行重设计，可选择：

• 单个结构文件（.pdb 或 .cif）
• 批量结构文件（压缩包格式）

多个模板结构时，每个模板结构都会用于设计。Number of Samples参数若设为10000，在默认抗体模板的情况下，每个模板结构的次数都约为3333。
如未提供自定义模板，系统将使用内置的默认抗体模板和纳米抗体模板，具体如下：
抗体模板：

• 6CR1 — Adalimumab（阿达木单抗，Humira）
  靶点：TNF-α
  作用：阻断 TNF-α 与受体结合，抑制炎症反应

• 6WGB — Dupilumab（度普利尤单抗，Dupixent）
  靶点：IL-4Rα
  作用：阻断 IL-4 / IL-13 信号通路，抑制 2 型炎症

• 3HMW — Ustekinumab（乌司奴单抗，Stelara）
  靶点：IL-12 / IL-23 p40
  作用：同时抑制 Th1 和 Th17 炎症通路

纳米抗体模板：

• 7EOW — Caplacizumab（卡普赛珠单抗）
  靶点：vWF A1 域
  作用：阻断 vWF 与血小板结合，抑制血栓形成

• 7XL0 — Vobarilizumab（ALX-0061，沃巴利珠单抗）
  靶点：IL-6R（+ 白蛋白结合）
  作用：抑制 IL-6 信号并延长半衰期

• 8COH — TPP-3444（Gefurulimab / ALXN1720 组成部分）
  靶点：补体 C5
  作用：抑制补体激活

• 8Z8V — ALB8（Ozoralizumab / ATN-103 组件）
  靶点：人血清白蛋白（HSA）
  作用：延长药物半衰期

• Gontivimab（ALX-0171，格替韦单抗）
  靶点：RSV F 蛋白
  作用：阻断病毒融合，抑制感染

• Isecarosmab（M-6495 / ALX-1141，艾司卡索单抗）
  靶点：ADAMTS-5
  作用：抑制软骨降解，具有抗炎作用

• Sonelokimab
  靶点：IL-17A / IL-17F
  作用：双重抑制炎症因子，增强抗炎效果

Number of Samples

采样的序列数量，值越大，采样空间越大，筛选序列质量越高，对应计算时间也更长，最大支持20000。

Number of Designs

完成设计后，最终给出的结构数量，默认为30，最大支持100。

Custom

Protocol

设计模式共有6种：

• Protein：设计与靶点（蛋白或多肽）结合的蛋白，也可脱离靶点仅设计蛋白单体。
• Peptide：设计与靶点蛋白结合的多肽（线性肽或环肽）。
• Small_Molecule：设计与小分子结合的蛋白，不改变小分子本身。
• Antibody: 设计与靶点结合的普通抗体，也可脱离靶点仅设计普通抗体自身
• Nanobody：设计与靶点结合的纳米抗体，也可脱离靶点仅设计纳米抗体自身。
• Redesign: 对已存在的蛋白/复合物结构，进行指定残基的重设计优化。

设计规则的定义有三种方式：

• 基于已有结构进行定义，可以是提取部分结构，也可以对部分结构进行设计。
• 基于序列进行定义，指定序列中哪部分需要设计，哪部分残基不变。
• 基于小分子文件进行定义，指定参与结合的小分子。

三种方式可以自由组合。

Structure

上传已有蛋白结构，从中提取已有结构，或重新设计部分结构。例如：从上传的结构中提取靶点链、抗原链、纳米抗体链等。

Chains

指定从Structure中提取的链名，可多选，如：A,B。如不设置该参数，表示提取结构中的所有链。

Include

从Chains参数指定的链中，进一步确认需要提取的残基范围，使用链名+残基位置（从1开始的顺序编号，非PDB的UID编号）进行指定，如A10-20,A25,B1-36,B40。
表示：从A链提取编号10至20、25的残基，从B链提取编号1至36、40的残基。
如不设置该参数，表示提取Chains参数中指定的完整链。

Exclude

从Chains参数指定的链中，确认哪些残基不提取），与Include参数作用相反，指定方式相同，如A15,B36-42（从1开始的顺序编号，非PDB的UID编号表示A链编号15、B链编号36至42的残基不提取。

Design Positions

已提取的结构中，指定需要重新设计的残基，指定方式同Include参数，如A10-12,B15,B40（从1开始的顺序编号，非PDB的UID编号）。
注意：需要重新设计的残基编号应在已提取的结构中存在。

Design SS

对要设计的残基，指定二级结构类型。使用链名,SS类型:残基范围（从1开始的顺序编号，非PDB的UID编号）进行指定，每行放置一个，如：

A,HELIX:10-12
B,SHEET:15,LOOP:40

二级结构类型可选：LOOP, HELIX, SHEET（大小写均可）。
不指定该参数表示不强制二级结构类型。

Binding Hotspot

指定哪些残基参与结合（如链间或与小分子结合），指定方式同Include，如A12,B15-18（从1开始的顺序编号，非PDB的UID编号）。

Non Binding

指定哪些残基不参与结合（从1开始的顺序编号，非PDB的UID编号)，与Binding参数作用相反。

Design Insertions

指定插入突变设计，使用链名,插入位置,插入残基长度,二级结构（从1开始的顺序编号，非PDB的UID编号方式定义，每行一个，如：

A,10,5
B,15,5-10,HELIX

表示在A链的10号残基位置后，插入5个新残基，二级结构不确定（不强制）。在B链的15号残基位置后，插入5至10个残基（具体残基数量随机确定），二级结构为HELIX。

二级结构类型的选择有3种(大小写皆可)： LOOP, HELIX, or SHEET

Structure Repetition

同Structure定义。例如：指定已有的Binder结构。

Repetition Chains

同Chains定义

Repetition Include

同Include定义

Repetition Exclude

同Exclude定义

Repetition Design Positions

同Design Positions定义

Repetition Design SS

同Design SS定义

Repetition Binding Hotspot

同Binding Hotspot定义

Repetition Non Binding

同Non Binding定义

Repetition Design Insertions

同Design Insertions定义

Sequence

指定要设计的蛋白序列，每行一条，如：

AAVTTTTPPP
15-20AAAAAAVTTTT18PPP

其中：

• 字母表示序列中明确的残基(设计中不变)
• 单个数值表示该位置要设计的长度，如18表示序列的该位置将设计18个残基。
• 数值范围表示长度范围（具体设计长度在范围内随机指定），如15-20表示该位置将设计15至20个残基，具体长度在15至20之间随机指定。

序列的ID默认从1开始按顺序编号。

Sequence Binding

指定序列中参与结合的残基，使用序列编号:残基范围格式，如：

1:5,8-10
2:30-35

表示第一条序列中编号5、8至10的残基参与结合；第二条序列中编号30至35的残基参与结合。
第二条序列中含有设计长度范围时，按最小长度计算残基位置。

Sequence Non Binding

指定序列中不参与结合的残基，与Sequence_Binding作用相反。

Sequence SS

指定序列中残基的二级结构类型，使用序列编号,SS类型:残基范围定义，每行一条，如：

1,HELIX:5-8
2,SHEET:15,LOOP:40

表示第一条序列编号5至8的残基，二级结构为HELIX；第二条序列编号15的残基，二级结构为SHEET，编号40的残基，二级结构为LOOP。

注意： 有指定设计长度范围的序列，按长度最小值来确认剩余残基的位置。

Sequence Cycle

指定需要环化的序列编号，如1,2表示第1和第2条序列首尾相连。

Ligand

指定参与结合的小分子信息，文本文件，支持SMILES或 CCD Code（化学组分词典编号）。如果使用SMILES格式，每行应包含一个小分子；如果使用CCD Code，每行可以包含一个或多个小分子，使用逗号分隔，并加上CCD前缀。示例如下：

CC(=O)OC1C[NH+]2CCC1CC2
CCD,ATP,HY3,P1L
CCD,MG

Covalent Bond

共价键信息的文本文件，TXT格式。每行放置一个共价键信息，每个共价键信息包含两个原子信息，每个原子信息由三部分组成：

• 原子所在序列或小分子的顺序编号（按上述参数设置的顺序，确定相应序列或小分子的顺序，从1开始编号。）
• 原子所在残基的位置编号（如残基为小分子时，编号为1）
• 原子的标准名称（CCD中定义）
  三部分由逗号分隔，例如：3,1,CA表示第三个实体（序列或小分子）中的第一个残基（或小分子）的CA原子
  一个共价键是由两个原子信息组成，原子间用分号分隔，如：1,1,CA;2,1,CA
  表示一个共价键，该共价键由两个原子组成，第一个原子为1,1,CA，第二个原子为2,1,CA
  包含多个共价键信息的文件内容示例如下：

1,1,CA;2,1,CA
1,1,CA;3,1,CHA

当小分子为SMILES时，如CC(=O)NCCNC(C)=O，如果该小分子的顺序编号（按上述方式确认）为3，其第一个C原子参与形成共价键，与编号为1的链/序列中第一个残基的CA原子，则共价键的定义为1,1,CA;3,1,C1其中C1表示小分子的第一个C原子，如果是第二C原子，用C2表示。

注意:

• 当前Covalent Bond的定义中，出现的序列不能是结构文件（Structure）中，只能是序列文件（Sequence和Ligand）中
• 序列中有指定设计长度范围的情况时，按长度最小值来确认后续残基的位置。如：15-20ACS，长度范围的序列长度按最小长度计算，即15，所以残基A的位置编号是16，C是17，S是18。
  共价键信息的文本文件，TXT格式。每行放置一个共价键信息，每个共价键信息包含两个原子信息，每个原子信息由三部分组成：
• 原子所在序列或小分子的顺序编号（按上述参数设置的顺序，确定相应序列或小分子的顺序，从1开始编号。）

Number of Samples

采样的序列数量，值越大，采样空间越大，筛选序列质量越高，对应计算时间也更长，最大支持20000。

Number of Designs

完成设计后，最终给出的结构数量，默认为30，最大支持100。

结果说明

输出参数文件design_spec.yaml
输出设计的复合物的序列文件，final_complex.fasta
输出设计的复合物的序列文件（Batch模式），final_complex_batch.fasta，适合一些模块的Batch模式的输入，如Structure Prediction (Boltz-2)
输出设计的链的序列文件，final_designed_chains.fasta
输出设计打分文件final_designs_metrics.csv，csv文件每个指标含义如下：

注意：只有设置Binding Hotspot参数，才会输出
输出设计的前5个结构rank1-5*.cif
输出最后设计的结构打包文件final_designs.tar.gz
输出设计的概述文件results_overview.pdf，包含结构的过滤 (Filtering Criteria)和排序标准(Sorting Criteria)。

• 过滤标准 (Filtering Criteria)

• 排序标准(Sorting Criteria)

设计教程

遮蔽肽设计教程

已知抗体结构

1. 抗体编号
应用WeView打开mH35抗体结构，进行抗体编号，确定重链CDR3的位置在H99-102，为遮蔽肽的结合位置

2. BoltzGen中输入参数设置

• 选择Custom模式
• Protocol中选择Peptide
• Structure中上传mH35抗体结构
• Chains中选择H和L链，作为受体链
• Binding Hotspot中输入受体的结合位点，为重链的CDR3区域：H99-102
  
• Sequence中输入需要设计的多肽长度，遮蔽肽建议设计长度是：5-30
  
• 提交运行

已知抗体序列

1. 抗体编号
应用WeSeq打开mH35抗体序列，进行抗体编号，确定重链CDR3的位置在99-102，为遮蔽肽的结合位置


2. BoltzGen中输入参数设置

• 选择Custom模式
• Sequence中输入mH35抗体重轻链的序列以及遮蔽肽的长度，一条链一行，遮蔽肽建议设计长度是：5-30
• Sequence Binding中设置受体的结合位点，为重链的CDR3区域：1:99-102
  
• 提交运行

环肽设计教程

已知受体结构

• Protocol中选择Peptide。
• Structure中上传受体结构。
• Binding Hotspot中定义受体中结合位点（如有）。
  
• Sequence的输入分以下两种情况：
  • 如果有模板结构，则输入模板环肽序列和拆入序列的长度，比如C8-9AC，在第1位残基C后面插入8-9个残基，首位C和末尾C构建环肽，如下：
    
  • 如果无模板结构，可直接输入序列长度，如8-10，预测与受体结合的8-10AA长度的环肽，如下：
    
• 成环情况分为以下两种：
  • 如果环肽是头尾肽键成环，可以在Sequence Cycle中填1。
    
  • 如果环肽是二硫键成环，则Sequence Cycle不填写，在Covalent Bond中填入首尾两个Cys生成二硫键的信息：1,1,SG;1,11,SG。
    
• 提交运行

已知受体序列

• Protocol中选择Peptide。
  
• 根据环肽情况，Sequence的输入分以下两种情况：
  • 如果环肽有模板结构，则输入受体序列、模板环肽序列及拆入序列的长度，如下图，每一行是一条序列，受体有2条序列，受体序列的ID分别为1、2。环肽序列位C8-9AC（在第1位残基C后面插入8-9个残基，首位C和末尾C构建环肽），环肽位于第三行序列ID为3。
    
  • 如果无模板结构，可直接输入受体序列和环肽的序列长度，如下图，预测与受体结合的8-10AA长度的环肽。
    
• Sequence Binding中定义受体中结合位点/非结合位点（如有）。
  
• 成环情况分为以下两种：
  • 如果环肽是头尾肽键成环，可以在Sequence Cycle中填3。
    
  • 如果环肽是二硫键成环，则Sequence Cycle不填写，在Covalent Bond中填入首尾两个Cys生成二硫键的信息：1,1,SG;1,11,SG。
    
• 提交运行

参考文献

• https://hannes-stark.com/assets/boltzgen.pdf