Antibody Design (RFantibody)

简介

设计能够靶向指定抗原表位的从头抗体结构。模块基于 RFantibody 方法实现，支持单域抗体（VHH/Nanobody）和单链抗体片段（scFv/Antibody fragment）的 de novo 设计。用户提供抗原结构、抗体框架或抗体-抗原复合物结构，并指定抗原上的结合热点或需要设计的 CDR 区域后，模型会生成能够结合目标表位的抗体候选结构。

RFantibody 基于RFdiffusion 蛋白生成模型构建和RoseTTAFold2（RF2）结构预测模型。研究团队在抗体结构数据上对 RFdiffusion 进行微调，使模型能够在保留抗体框架整体稳定性的同时，对互补决定区（CDR）进行构象和序列层面的设计。
RFantibody 的设计流程主要包括三个阶段。首先，模型根据用户提供的抗原结构、抗体框架和热点残基，在三维空间中生成抗体 CDR loop 与抗原表位的结合构象。其次，使用 ProteinMPNN 对设计区域进行序列设计，使 CDR 序列能够支撑生成的 loop 构象并与抗原形成互补相互作用。最后，使用微调后的 RF2 对设计得到的抗体-抗原复合物进行结构预测和自一致性评估，并根据界面置信度、结构置信度和 CDR 序列信息对候选结果进行排序。

RFantibody 论文对多个疾病相关靶标进行了湿实验验证，包括流感血凝素（HA）、呼吸道合胞病毒（RSV）表位、SARS-CoV-2 RBD、艰难梭菌毒素 B（TcdB）和 IL-7Rα 等。实验结果显示，设计得到的 VHH 和 scFv 能够在多种靶标上获得可测量结合活性，并且部分候选通过 SPR、cryo-EM、中和实验和亲和力成熟进一步验证。代表性结果包括：流感 HA 靶向 VHH 的 KD 可达到 78 nM；TcdB 靶向 VHH 的 KD 可达到 260 nM，并在中和实验中表现出功能活性；TcdB 靶向 scFv 的 KD 可达到 72 nM。cryo-EM 结构也显示多个设计模型与实验复合物结构高度一致。

RFantibody 适用于以下典型场景：

• 已知抗原结构，希望针对指定表位设计全新的 VHH 或 scFv。
• 已有抗体框架，希望只重设计一个或多个 CDR 区域。
• 已有抗体或复合物，希望只重新设计指定残基。
• 希望获得多个候选抗体结构，并根据界面预测置信度和结构质量进行排序筛选。

Wemol上的RFantibody已经特殊优化，加速RFdiffusion的性能，约2x的加速。

参数说明

模块提供 De Novo Antibody 和 Custom 两种模式。前者基于抗体模板进行从头设计，后者使用用户提供的抗体或复合物，设计 CDR 或指定残基。

当前仅支持单链抗原；如果原始结构包含多条抗原链，请先保留目标抗原链。上传抗体统一使用 Chothia 规则进行编号和 CDR 注释，无需选择编号方案。

De Novo Antibody

Type

指定抗体设计类型。

• Nanobody：单域抗体 VHH，包含重链可变区，可设计 H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。
• Antibody：包含重链和轻链可变区的抗体片段，可设计六个 CDR。

选择的类型应与模板一致。scFv 输入中的 VH/VL 域会分别参与设计，输出为两条抗体链。

Antigen

上传目标抗原结构，支持 PDB、CIF/mmCIF 格式。
文件应只包含目标抗原的一条蛋白链，并保留目标表位及其周围的完整结构。可提前去除无关区域以降低计算开销；不要删掉表位附近的关键残基。

Template

指定用于设计的抗体框架，可使用内置模板或上传 PDB、CIF/mmCIF 文件，也支持 ZIP 中包含多个模板。

默认值： 不上传时使用所选 Type 对应的全部内置模板。

系统自动识别抗体可变域，移除恒定区和无关组分，并按 Chothia 注释。模板主链应完整；无法唯一识别抗体域时，需要明确选择相应重链或轻链。
后三个 Nanobody 模板为计算框架。

H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3

指定各 CDR 的设计长度。支持固定长度（如 7）或闭区间范围（如 5-13），范围内会采样不同长度。

默认值： 所有 CDR 参数都未填写时，采用下表配置。

只要手动填写了一个或多个 CDR 参数，就只设计这些 CDR；其余 CDR 不自动补入上表默认值，保留输入长度和序列约束。

Binding Hotspot

指定抗原上希望靶向的热点，格式为原始抗原链名加顺序位置或范围，例如 A10,A25-27。

这里的位置是上传文件中，该抗原链有坐标的标准氨基酸从 1 开始的顺序位置，不是 PDB 作者编号。
即使只有一条抗原链，也应填写链名；多个位点用逗号分隔，支持中文逗号和全角数字。热点应位于保留的抗原结构内。

ProteinMPNN Temperature

控制 ProteinMPNN 的序列采样温度。默认值为： 0.000001。

可填写大于 0 的有限数，例如 0.2。较高温度通常会增加序列采样的随机性；温度不参与最终结构排序。不填写时沿用当前默认值。

Number of Designs

指定每个模板生成的候选数量。

默认值： 20；必须为正整数。

使用多个模板时，总设计数量为“模板数 × Number of Designs”。例如，使用全部 7 个 Nanobody 模板且数量为 20 时，共生成 140 个候选。
该参数控制生成数量，不是从更多候选中挑选后返回的数量。

Custom

用于已有抗体的 CDR 重设计或指定位点设计。输入可选 Complex，或分别提供 Antigen + Antibody，两种方式不能同时使用。
本模式根据上传结构识别 VHH 或重/轻链可变域，无需另选 Type。

Complex

上传抗体–抗原复合物，支持 PDB、CIF/mmCIF 格式。

不填写时必须分别提供 Antigen 和 Antibody。

复合物中应包含一条目标抗原链，以及可识别的抗体可变域。填写后不能再同时填写 Antigen 和 Antibody。
系统会提取抗原及抗体并保留原始编号的对应关系。先前输出的 A/B 或 A/B/C 复合物也可以重新上传。

Antigen

上传单链抗原结构，支持 PDB、CIF/mmCIF 格式。

未提供 Complex 时必填。

结构应包含目标表位。与抗体分别上传时，不要求二者已经具有结合构象。

Antibody

上传抗体框架结构，支持 PDB、CIF/mmCIF 格式。

未提供 Complex 时必填，不自动使用内置模板。

系统自动提取可变域并按 Chothia 注释。VHH 使用重链可变域，双链抗体使用重/轻链可变域。
scFv 的两个可变域会拆分为两条抗体链参与设计，不保留连接肽。识别存在歧义时，需要明确选择重链或轻链。

Residues

指定允许重新设计的抗体位点，格式为“原始链名 + 顺序位置或范围”，例如：

H27,H28,H99,H100-103,L24-32

示例表示选择原始 H 链第 27、28、99、100–103 位和 L 链第 24–32 位。
使用 Complex 时，按原始复合物中的抗体链名填写；例如抗体重链名为 B，应填写 B27。

填写规则：

• 位置按原始输入链中有坐标的标准氨基酸从 1 开始计数，不是作者编号、Chothia 编号或重编号后的位置。
• 原始同一条 scFv 链中的轻链域继续按整条链计数，不重新从 1 开始。
• 可选 CDR 内或保留的框架区位点；抗原、恒定区、连接肽、未选抗体域及越界位置不能用于设计。
• 支持范围、重复位点去重、中文逗号和全角数字；多字符链名使用 AA:27-30。
• 与六个 CDR 长度参数互斥。启用后保持各链长度，只允许选中位置重新采样，其余位置序列固定。
• 选中位置可能保留原氨基酸；该参数不是 A27G 形式的指定氨基酸替换。

结构采样和后续 RF2 预测可能改变最终坐标，不能将“固定序列”理解为所有未选原子的坐标完全不变。

H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3

按整段 CDR 进行设计，支持固定长度（如 7）或长度范围（如 5-13）。

默认行为与填写规则：

• 填写任意 CDR 参数时，只设计所填 CDR；其余 CDR 保留输入长度和序列约束。
• 如果六个 CDR 和 Residues 全部留空，当前流程会按输入长度设计所有存在的 CDR，并不是“不做设计”，也不会因缺少 CDR 参数自动报错。
• 如果只希望设计局部区域，应明确填写相应 CDR 或 Residues。
• 不能与 Residues 同时设置。VHH 只可填写 H-CDR1/2/3。
• 未选区域保留序列约束，不承诺最终预测坐标完全不变。

Binding Hotspot

指定抗原上的热点，格式为原始抗原链名加作者残基编号，例如 A305,A456,A460-465。

Custom 模式的热点使用原始 PDB/mmCIF 作者编号，与 De Novo 的热点顺序位置、Residues 的抗体顺序位置不同。
建议填写实际抗原链名；单链抗原也兼容 T305,T456 写法。
如果作者编号因插入码而不唯一，或编号不在上传结构中，会报错，应先整理输入结构及相应热点编号。

ProteinMPNN Temperature

控制 ProteinMPNN 序列采样温度，同时适用于 CDR 设计和 Residues 设计。默认值为： 0.000001。

可填写大于 0 的有限数，例如 0.2。不填写时保留原默认值；该参数不改变位点选择或固定位置约束。

Number of Designs

指定本次输入生成的候选抗体数量。

一个 Custom 任务使用一组抗体与抗原输入，因此该数量也是任务的总设计数量。

结果说明

两种模式均输出抗体–抗原复合物、抗体序列和评估指标。候选按 ipAE 从低到高排序；ipAE 相同时按 pLDDT 从高到低排序，再按源文件名稳定排序。

最终链名统一为 A：抗原，B：重链/VHH，C：轻链。VHH 复合物为 A/B，双链抗体复合物为 A/B/C。

cdr_sequences.csv 字段如下：

显式选择 CDR 时只输出相应 CDR 列；Residues 模式或未显式指定 CDR 时输出所有存在的 CDR 列。
不存在的轻链 CDR 不输出。Residues 模式展示某段 CDR 序列，不代表该段全部参与设计，具体变化以 residue_changes.csv 为准。

Design_ID,CDR_H3,ipAE,pLDDT
rank_1,IAYTPGAPLF,8.91,0.92
rank_2,VAPSKTDALF,9.29,0.92

residue_changes.csv 包含原始链名、顺序位置、作者编号/插入码、最终链名和实际编号、原氨基酸、设计氨基酸及是否改变。
序列和编号映射用于追溯来源；CDR 长度发生变化时，不能直接将输入编号当作最终结构编号。

可参考 ipAE < 10、pLDDT > 0.8 筛选候选，并结合界面接触和实验结果判断。系统不会按这些阈值自动删除候选，分数本身不等于实测亲和力。

设计教程

De Novo Antibody

1. 选择 Nanobody 或 Antibody，上传单链抗原结构。
2. 使用默认模板库，或上传与类型一致的抗体模板。
3. 保留默认 CDR 配置，或明确填写希望设计的 CDR。例如，只填写 H-CDR3=5-13 时只设计 H-CDR3。
4. 可选填写热点，例如 A10,A25-27，按上传抗原链的顺序位置计数。
5. 设置每模板设计数量和可选的 ProteinMPNN 温度，确认总候选数量后提交。

Custom

1. 上传 Complex，或者分别上传 Antigen 与 Antibody；抗原仅保留一条链。
2. 选择一种设计方式：填写 CDR 长度，或者填写 Residues。例如，原始抗体链名为 H/L 时可填 H99-103,L30-32。
3. 可选填写抗原热点，例如 A305,A456，按原始作者编号填写，不与 Residues 的顺序位置混淆。
4. 填写设计数量，可选调整 ProteinMPNN 温度后提交。
5. 查看 rank_1.pdb、cdr_sequences.csv 和 FASTA；使用 Residues 时同时检查 residue_changes.csv。

参考文献

• Bennett NR, Watson JL, Ragotte RJ, Borst AJ, See DL, Weidle C, Biswas R, Shrock EL, Leung PJY, Huang B, Goreshnik I, Ault R, Carr KD, Singer B, Criswell C, Vafeados D, Sanchez MG, Kim HM, Torres SV, Chan S, Baker D. Atomically accurate de novo design of antibodies with RFdiffusion. DOI:10.1101/2024.03.14.585103